谷胱甘肽转移酶
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Small Extracellular Vesicles Have GST Activity and Ameliorate Senescence-Related Tissue Damage
作者：Juan Antonio Fafian-Labora, Jose Antonio Rodr?guez-Navarro, and Ana O’Loghlen(Epigenetics & Cellular Senescence Group, Blizard Institute, Barts and The London School of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London, 4 Newark Street, London E1 2AT, UK. Instituto Ramon y Cajal de Investigaciones Sanitarias, Neurobiolog?á-Investigacion, Hospital Ramo ′n y Cajal, Ctra Colmenar km 9.1, 28034Madrid, Spain)
发表情况：Cell Metabolism 32, 71–86 July 7, 2020. doi: 10.1016/j.cmet.2020.06.004.
科学问题
人们一直都未停止对于抗衰老的探索，目前研究中大多数抗衰老药物都是有毒性的，而EV是一种天然来源的药物，不会引起毒性或免疫原性。早前已有研究表明年轻小鼠的血液具有使老年小鼠恢复活力的能力，那么这其中细胞外小泡(EVs)是否参与其中呢？
重要发现
1. SEV-Y改善某些衰老和衰老的细胞生物标志物。
2. 与SEV-O相比，GSTM2富含SEV-Y。
3. SEV-Y具有固有的GST活性，可提高小鼠和人的GSH水平。
4. SEV-YS降低老龄小鼠和人成纤维细胞ROS积聚和脂质氧化。
中文摘要
衰老是一个以不同特征为特征的细胞和组织功能障碍的过程，包括细胞衰老。然而，有证据表明，衰老和衰老的某些特征是可以改善的。在这里，作者提供的证据表明，从年轻捐赠者的原代成纤维细胞中分离的小细胞外小泡(SEV)可以改善老年和Hutchinson-Gilford早衰症捐赠者来源的细胞中某些衰老的生物标志物。重要的是，来自年轻细胞的SEV可以改善老年小鼠各种组织中的衰老。从机制上讲，作者发现SEV具有固有的谷胱甘肽-S-转移酶活性，部分原因是从老年的成纤维细胞衍生的SEV中高水平表达重组GSTM2转染到由老年成纤维细胞衍生的sEVs中可以恢复其抗氧化能力。恢复了它们的抗氧化能力。在体内和体外，SEV均能提高还原型谷胱甘肽水平，降低氧化应激和脂质过氧化作用。总之，作者的数据显示了SEV作为衰老再生疗法的潜力。
英文摘要
Aging is a process of cellular and tissue dysfunction characterized by different hallmarks, including cellular senescence. However, there is proof that certain features of aging and senescence can be ameliorated. Here,we provide evidence that small extracellular vesicles (sEVs) isolated from primary fibroblastsofyoung human donors ameliorate certain biomarkers of senescence in cells derived from old and Hutchinson-Gilford proge- ria syndrome donors. Importantly, sEVs from young cells ameliorate senescence in a variety of tissues in old mice. Mechanistically, we identified sEVs to have intrinsic glutathione-S-transferase activity partially due to the high level expression of the glutathione-related protein(GSTM2). Transfection of recombinant GSTM2 into sEVs derivedfrom old fibroblasts restores their antioxidant capacity. sEVs increasethe levels ofreduced glutathione and decrease oxidativestress and lipid peroxidation both in vivo and in vitro. Altogether, our data provide an indication of the potential of sEVs as regenerative therapy in aging.
结 果
图1 年轻供体细胞条件培养液的不同组分对老年受体成纤维细胞的功能分析
(A)三个(AG06240，AG13152和AG13222)到四个(AG16086，AG06240，AG13152和AG13222)来自老年供体的不同细胞用来自3-4个年轻细胞的混合条件培养液(CM)和分离的组分(SF，可溶性组分；大和小的细胞外囊泡，LEVS和SEV，)。衰老标志物染色阳性细胞百分率的定量：通过BrdU掺入(左)、p16INK4A(中)和p21CIP1(右)染色测量细胞增殖。数据代表了3-4个老细胞系中2个独立实验的平均值±SEM。FBS 10%代表用培养基处理的细胞作为对照。进行t检验分析。*p<0.05；**p<0.01；ns，不显著。(B)老细胞(CM-old)和年轻细胞(CM-Young)经CM处理的老细胞系AG16086的p16INK4a和BrdU染色的代表性图片。(C)AG16086(老成纤维细胞)用来自老(SEV-old)或年轻(SEV-Young)细胞的SEV处理的代表性图片。(D)生长曲线，表示4个老年供体细胞系在不同时间点(以天为单位)经SF或来自青年或老年供体的SEV处理后的相对细胞数的平均值±扫描电镜(SEM)。空腹血糖10%为对照。采用双因素方差分析。*p<0.001。(E和F)年轻或老年供体SEV处理的4个老年细胞系衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-b-Gal)活性(E)和IL-8染色定量的代表性图片(F)。图中显示了来自AG16086的代表性图像。采用t检验分析。**p<0.01；ns，不显著。(G)SEV返老还童潜力的传输示意图。初级衰老是指通过激活H-RasG12V而衰老的供体细胞(IRAS细胞)，二级和三级衰老是指从IC细胞(ICsEV)或IRAs细胞(RASsEV)分离的SEV处理的IRAs细胞。(H)定量聚合酶链反应(QPCR)检测正在经历初级和次级衰老的细胞的SASP mRNA水平。给出了3个独立试验的平均值。(I)4个年轻或4个老年供体细胞每隔72h用所示SEV进行长期处理，并以年轻和老年供体细胞加培养液(FBS 10%)作为对照。不同时间用细胞计数±扫描电镜测定细胞增殖。采用双因素方差分析进行统计分析。*p<0.001。(B、C和E)比例尺，50毫米。
图2 SEV-Ys改善HGPS患者来源的成纤维细胞中与衰老相关的细胞表型
(A)来自HGPS患者的3或4个不同的细胞(AG11572、AG06917、AG07493和AG10677)用混合条件培养基(CM)和3-4个混合年轻细胞的组分(SF、LEV和SEV)处理。对BrdU(左)、p16INK4A(中)和p21CIP1(右)染色阳性的细胞百分比进行定量。数据代表3-4个HGPS衍生细胞系的2个独立实验的平均值±SEM，FBS 10%代表培养基处理的细胞作为对照。进行t检验分析。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.01；ns，不显著。(B和C)AG11572(HGPS来源的成纤维细胞系)的代表性图像，用(B)CM或(C)来自HGPS或年轻捐赠者的SEV处理。比例尺，50毫米。(D)4种HGPS来源的成纤维细胞经SF或SEV组分处理72h后的长期生长曲线，在不同的时间重复计数。数据显示相对细胞数随时间变化的均值±扫描电镜(以天为单位)。采用双因素方差分析。*p<0.001。
图3 SEV-Y富含与谷胱甘肽结合相关的蛋白质，并改善老年供体来源的成纤维细胞中的ROS水平
(A)一项发表的蛋白质组学分析(Borghesan等人，2019年)，分析从IC成纤维细胞分离的SEV和来自衰老细胞的SEV(IRAs和依托泊苷治疗)。与IRAS和依托泊苷的SEV相比，作者发现IC来源的SEV富含55个蛋白质。(B和C)String(B)和Reactome Path Analysis(C)对IC的SEV中富集的55种蛋白质进行了分析，突出了GSTM2突出显示的谷胱甘肽代谢途径。(D)从青年、老年、andHGPSfibroblastsloadingthesamenumberofsEVs(33109).分离的GSTM2和ALIXINS EV的免疫印迹。从所有四个细胞系分离出的SEV如图所示。(E)GSTM2免疫印迹与Alix的密度定量。进行t检验分析。*p<0.05；**p<0.01。(F)用Optiprep对SEV进行密度梯度处理，并对不同组分的GSTM2和TSG101进行免疫印迹，显示存在含有GSTM2的SEV。(G)4例老年成纤维细胞经CM和其他年轻细胞组分处理后，用8-oxodG染色进行ROS定量。进行t检验分析。**p<0.01；ns，不显著。(H)经SEV-Y和SEV-O或FBS 10%处理的GM05565(老年细胞系)8-oxodG染色的代表性图片。(I)用年轻供体CM和分离物处理的4个老年成纤维细胞p-低矮H2AX染色的IF定量。进行t检验分析。**p<0.01；***p<0.001；ns，P-gH2AX染色IF值无显著性差异。(J)AG16086(老年细胞系)基础水平或经SEV-Y或SEV-O处理的p-gH2AX图片。(H和J)刻度尺，50毫米。(G和I)FBS 10%为阴性对照。
图4 GST活性和GSH水平在介导老年供者SEV-Y返老还童过程中起重要作用
(A)从4个不同的年轻供者分离的SEV具有独立的GST活性。来自老年捐赠者的SEV及其分别来自年轻捐赠者和老年捐赠者的SF部分不呈现GST活性。采用t检验分析。**p<0.01。(B)用年轻或老年供者的SEV培养的老年成纤维细胞中GST活性被测定。以10%胎牛血清作为对照。数据显示了4种不同供体细胞的平均扫描电镜。采用t检验分析。*p<0.001；ns，不显著。(C)经SEV和不同浓度(20或40 mM)的BSO(丁硫氨酸亚砜)处理的老年细胞的GSH/GSSG比值，可阻止GSH的从头合成。在BSO处理后，用SEV-Y处理老年细胞时，GSH/GSSG水平的升高被阻止。*p<0.05；**p<0.01；ns，不显著。(D)相对细胞数显示经SEV-Y处理的老年细胞增殖增加，这可被谷胱甘肽抑制物(BSO)所阻止。**p<0.01。E)20 mM BSO可阻止SEV-Ys对SA-b-Gal活性的下调。*p<0.05；**p<0.01。(F和G)IC或IRAs HFFF2细胞用异位表达myc-Gstm2或空载体的IC或IRAs来源的SEV处理。给出了三个独立实验的平均值±SEM。(F)对SA-b-Gal活性进行了定量，(G)给出了具有代表性的图像。**p<0.01；ns，不显著。(H)将重组GSTM2(RGSTM2)转染老年SEV所遵循的方案图。(I) 4个年老供体细胞用从年老供体和年轻供体中分离的sEVs进行处理，分别转染IgG或rGSTM2 (rGSTM2- sev)。rGSTM2作为阳性对照单独用于老年供体细胞。显示SA-b-Gal活性定量和代表性图片。**p<0.01；ns，不显著。
图5 SEV-Ys处理的老年小鼠衰老和衰老的不同生物标志物的分析
(A)序贯腹腔注射的实验设置示意图。注射SEV-Y 20 mg，每周2次，共3周。每种情况下使用5只22到24个月大的小鼠。(B和C)免疫组织化学(IHC)染色和定量SA-b-Gal在小鼠和老年小鼠肝、肾、肺和棕色脂肪组织(BAT)组织切片中的染色和定量，SEV-Y治疗前后的小鼠肝、肾、肺和棕色脂肪组织(BAT)组织切片中SA-b-Gal免疫组织化学染色和定量。核固红染色也可见。每种条件下3只幼鼠和5只小鼠SA-b-Gal活性的代表性图片(B)和定量(C)。采用Welch‘s t检验。(D)用qPCR方法测定经SEV-Ys处理的幼年、老年和老年小鼠肝、肾和肺中CdKN2a mRNA的相对水平。进行方差分析。(E)显示经SEV-Ys处理的幼年、老年和老年小鼠肝和肾中SASP不同组分的平均mRNA水平的热图。(F)ELISA法检测实验小鼠血清中IL-6和GM-CSF的含量。数据表示每个条件下2只青年小鼠和5只老年小鼠的平均扫描电镜。采用Welch‘s t检验。(D和E)3只小鼠作为青年对照组，5只老年小鼠，5只老年SEV-Y治疗组。
图6 SEV-Y预防老年小鼠ROS蓄积和提高GSH水平
(A)测定了幼龄小鼠(n=3只)和老年小鼠(n=5只)经SEV-Y治疗前后肝脏和血清中的氧化应激(ROS)水平。数据代表均值±扫描电镜。采用t检验分析。(B)GSTM2在幼年和老年处理或未处理小鼠肝脏中表达的代表性免疫印迹。以GAPDH作为负荷对照，每种条件下5只小鼠定量。(C)测定不同幼龄、老年、经SEV-Y治疗或未治疗的小鼠的肝脏和血清中的GST活性(n=3只年轻小鼠和5只老年小鼠各5只)。数据代表均值±扫描电镜。采用t检验。(D)对年轻、老年、经SEV-Y处理或未经处理的老年小鼠肝脏中与抗氧化途径相关的不同转录物进行qPCR分析(n=3只年轻小鼠和n=5只老年小鼠每种情况)。进行Mann-Whitney检验。
图7 SEV-Ys在体外和体内改善脂质过氧化作用
(A和B)经SEV-Y治疗后，年轻和老年小鼠中的MDA水平，(A)肝和(B)血清。数据代表3-5只小鼠的平均±SEM。采用t检验分析。(C)IRAs细胞经IC或IRAs的SEV处理后的MDA含量，以及表达或不表达myc-Gstm2的IRAs细胞的MDA含量。数据显示了3个独立实验的平均值±SEM。*p<0.05；ns，不显著。(D)用20 mM BSO处理过的年轻或老年供体分离出的SEV与老年供体成纤维细胞孵育后，丙二醛的含量测定。曲线图代表了4个老年供体成纤维细胞的平均值±扫描电镜。*p<0.001；ns，不显著。(E)增加4-HNE浓度(1.25、2.5和5 mM)处理的年轻HFFF2成纤维细胞的生长曲线。以IRAs作为阳性对照。数据代表3个独立实验的平均值±SEM。采用双因素方差分析。*p<0.001。(F)如果用不同的siRNA分析4-HNE处理的年轻成纤维细胞衰老的生物标记物(SA-b-Gal和p16INK4A)，则以多种调节衰老的途径为目标。使用针对p16(Si16)、p53(Sip53)、NF-kB(Si65)和C/EBPb(SiCEBP)的50 nM siRNA。SCR是一种非靶向控制。*p<0.001。(G)4-HNE处理的年轻HFFF2细胞与SEV-Y孵育与否的MDA水平。*p<0.001。(H)4-HNE和不同靶向IKK(NF-kB通路；20 mM CAY10576)或ROS(100 NM NAC)抑制剂处理的HFFF2细胞中SA-b-Gal的定量。以SEV-Y作为阳性对照。*p<0.05。
总 结
作者的数据显示，从年轻人健康供体(SEV-Y)分离的成纤维细胞(SEV-Y)来源的SEV具有预防老年人捐赠者、正在经历癌基因诱导衰老的细胞以及来自Hutchinson-Gilford早衰综合征(HGPS)(一种严重加速衰老形式)的成纤维细胞衰老的生物标志物的能力。有趣的是，虽然可溶性部分(SF)也改善了衰老的增殖抑制特性，但与EV相比，其效果是温和的，而EVS(LEVS)则没有显示出任何功能。重要的是，作者发现SEV-Y与SF相比具有固有的GST活性，并且增加了谷胱甘肽-S-转移酶mu2(GSTM2)的蛋白表达水平。此外，SEV-Y还具有逆转活性氧(ROS)在体外和衰老小鼠某些器官中积累和防止脂质过氧化的能力。综上所述，作者发现SEV-Ys可以改善某些器官在体外和体内的衰老和衰老的各种特征。根据作者的结果很容易推测SEV-Y对老年小鼠的组织具有恢复活力的潜力，但作者必须谨慎地得出这样的结论，因为需要更多的实验数据。然而，我们不能否认SEV-Y正在帮助受损组织修复，这也是一个非常有吸引力的工具。进行更长期的实验来确定SEV-Y具有恢复或修复功能将是很有趣的。
